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ips技術在研究中存在的技術問題及優化方法
      
  誘導多能干細胞(iPS)是通過導入特定的轉錄因子使成體細胞直接重編程為胚胎干細胞(ESCs)樣的多能性干細胞(Takahashi and Yamanaka,2006)。
  1.1 最初獲得iPS技術路線
  2006年,日本Yamanaka研究小組采用體外基因轉染技術,從24個基因中篩選出能使成體細胞轉變成干細胞的基因,通過研究最終確定了Oct4、Sox2、c—Myc和Klf4 4個轉錄因子基因;通過逆轉錄病毒將上述4個轉錄因子基因導入小鼠皮膚成纖維細胞中;在胚胎干細胞培養條件下,以Fbxl5為標記物進行篩選,獲得了Fbxl5+的干細胞。新獲得的這種細胞系在細胞形態、生長特性、表面標志物等方面與胚胎干細胞非常相似,將這些克隆狀細胞放在飼養層上進行培養,每個細胞都顯示出與胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)相似的形態。經鑒定,這些iPS無論在形態學上還是在分子水平上,其特性均與ESCs高度相似。在疾病治療中的用途 Hanna等將小鼠皮膚的成纖維細胞重編程為誘導性多潛能干細胞,再定向誘導其分化為造血干細胞, 移植后用于治療人類鐮狀細胞性貧血的小鼠動物模型,取得顯著的治療效果,具體應用如圖1。
  圖1 利用Ips治療鐮刀狀紅細胞貧血病模型
  1.2 iPS誘導形成的機制
  在體細胞重編程過程中,體細胞特異表達的標記基因(如成纖維細胞的Thy1)首先被抑制;隨后多潛能性細胞的一些特異表型出現,如堿性磷酸化酶和SSEAl的表達;在iPs細胞形成的晚期,才激活內源性的Oct4、Sox2和Nanog等多潛能性細胞特異的轉錄因子;在重編程晚期還可檢測到X染色體的激活、端粒酶活性的增加和端粒長度的延長。這些基因的激活與抑制都伴隨著組蛋白表觀遺傳修飾和染色質結構的變化。C—Myc在重編程早期抑制體細胞特異表達的標記基因中起重要作用,其他3個因子Oct4、Sox2和Klf4則在激活多潛能性細胞的標記基因中起作用。如果未能有效地激活多潛能性標記基因(特別是晚期激活的多潛能性基因)和改變它們的表觀遺傳修飾,細胞就處于部分重編程的狀態。
  1.3 iPS研究的意義
  iPS 細胞同樣具有自我更新和分化的全能性,其功能與胚胎干細胞類似,無需制造胚胎, 從任何組織的細胞都可以制造出具有干細胞功能的細胞, 避免了轉基因面臨的倫理問題, 更重要的是簡化了制備轉基因動物的過程。iPS 產生機理與相關技術的深入研究,將會給治療人類疑難疾病、組織修復與再生以及生物制藥等諸多生物醫學領域帶來新的發展機遇。源自患者的誘導多能干細胞,進一步用于自體移植可避免免疫排斥問題,目前故iPS細胞的誕生被譽為生命科學領域新的里程碑。
  1.4 iPS研究成果
  自1962年,Gurdon將某些特定的成體細胞如青蛙的皮膚細胞,經過適當的移植實驗,產生新的蝌蚪以來,Ips技術的研究有了突飛猛進的發展。如2012年10月8日,英國研究員John B.Gurdon和日本科學家Shinya Yamanaka,因為在Ips的成體細胞重編程成為干細胞的研究中做出了巨大貢獻,共同獲得2012年的諾貝爾生理學或醫學獎。2013年6月,美國Smith對誘導多能干細胞進行分化,在試管內制造出了無數的人類紅血細胞和血小板。2013年7月,美國Samuel等使用人體誘導多能干細胞制造出能在實驗鼠體內存活280d的人造血管。其他發展歷程中的重大事件.
  2 . iPS的發展進程
  2.1iPS相關因子的功能
  Oct 4( Octamer- binding Transcription Factor4,八聚體轉錄因子4 ) 基因是P O U轉錄因子家族成員之一,是參與調控胚胎干細胞自我更新、維持其全能性、細胞增殖的最重要的轉錄因子之一,是參與誘導多能干細胞重編碼過程最為重要的因子。Oct4是維持ESC全能性和自我更新的關鍵基因,在未受精的受精卵卵母細胞中即可表達。當敲除Oct 4或Oct 4發生突變時,胚胎不能形成內細胞團,擬胚體發生凋亡,胚胎干細胞喪失全能性。Oct 4與Nanog、Sox2形成網絡調節通路,調控胚干細胞的全能性。這3種基因對大量基因通過前饋系統、自身調節網絡與其他信號轉導通路調控來維持胚胎干細胞維持全能性及抑制分化。
  Sox2基因是SRY(性別決定基因)超家族相關的轉錄因子Sox家族成員,在動物界廣泛存在。Sox2基因是細胞重編程的重要基因之一,參與細胞的形成,維持胚胎干細胞全能性和自我更新,決定動物性別與分化、神經系統發育、眼的發育等過程。作為Oct4基因的協同基因,Sox2在胚胎形成過程中,Oct4和Sox2含量會逐漸降低,Sox2突變可能引起Oct4基因突變,進而引發干細胞喪失全能性。
  Nanog是NK家族基因,參與維持胚胎干細胞全能性,與生殖細胞腫瘤生成的關系密切,參與人成纖維細胞重編程為iPS過程。Nanog突變體會導致擬胚體的形成缺陷,缺失不會影響干細胞自我更新能力和形成胚胎嵌合體的能力,但會促進Es細胞多向分化,使胚胎內胚層自發分化為內臟、體壁和腔室,而其他胚層細胞凋亡。因此,Nanog在胚胎干細胞中的作用相當于一個開關,調節ES細胞自我更新和多向分化。
  Klf4是Klf蛋白家族的成員之一,具有多串聯型鋅指結構,參與調控細胞的增殖、分化。與Oct4、Sox2和c—Myc共同調控干細胞自我更新和維持全能性,參與人和小鼠體細胞重編程為iPS過程。敲除或低表達Klf4基因不會導致胚胎凋亡,不會影響其自我更新和胚胎發育但會導致遺傳疾病。
  c—Myc基因是細胞癌基因的重要成員,參與細胞生殖、分化調節過程,在小鼠體細胞重編碼為iPS過程中起重要作用,調節造血干細胞的自我更新和分化。Nakagawafz等研究發現,在小鼠體細胞重編程過程中c—Myc可敲除,并提高重編程率、降低腫瘤發生。
  2.2 iPS研究中存在的技術問題及優化方法
  實驗證明.iPS細胞功能幾乎和ESC一樣,表達ESC的各種表面標記.可分化為各種組織細胞。但還有很多問題有待解決。(1)c—Myc和Klf4屬于致癌因子.用病毒作為載體.可能使致癌因子整合到受體基因組內.引發基因突變產生高致癌性的iPS細胞。(2)iPS細胞產生的效率較低,重組率只有0.1%左右。究其原因可能是0ct-4在胃或腸內的表達阻止了原始細胞的分化或者其他在維持多能性中起重要作用的多聚蛋白以及染色體組的修飾因子ISW I和Brgl被插入的逆轉錄病毒激活。(3)安全性問題,誘導生成多功能干細胞的方法大多都涉及到病毒基因及反轉錄病毒載體的使用,這有可能使所誘導的細胞發生異常。(4)由于急性免疫排斥反應的存在,來源于多能干細胞的組織在移植后的存活率很低。
  解決成瘤性問題、表觀遺傳學問題、移植排斥問題及提高效率,是將來研究iPS細胞需要解決的主要問題。據此,在具體實踐中提出以下優化方法:(1)轉錄因子及誘導策略的選擇,以此既保證安全性,又提高誘導效率。A、小分子化合物誘導,在誘導過程中導入一些小分子化合物不但可以促進細胞重編程,甚至可以取代某些轉錄因子的作用。例如,最早發現的BIX-01294(組蛋白甲基轉移酶G9a的抑制劑)可以取代Oct4。也有發現表明細胞內信號分子Wnt3a可以替代原癌基因c-Myc,并提高重編程效率。B、簡化過程:有報道稱,使用Ascl1、Brn2和Mytl1這3種因子可避開多能干細胞誘導步驟,在體外將MEF(小鼠胚胎成纖維細胞)直接轉變成有功能的神經元。簡化誘導步驟使得安全性和誘導效率都得到了很大程度的提升。 C、蛋白質誘導多能干細胞,丁盛等( 2009) 報道,在細胞穿膜肽的協助下直接將轉錄因子編碼的蛋白導入MEF,使其成為可長期自我更新的蛋白誘導多能干細胞(protein-inducedplu-ripotent stemcells,piPSCs) ,從而取代基因誘導,這種方法避免了遺傳修飾,安全性高,被譽為干細胞領域的二次革命。但大大降低了iPS的生成率,技術上有待進一步改進。D、RNA誘導多能干細胞,近期有研究者在重編程過程中加入一些微小RNAs(miRNAs),發現這些小分子能取代一些重編程因子或提高重編程的效率和速度,可能產生更加安全的ips細胞。例如:Derrick等將4個關鍵蛋白質的mRNA導入人皮膚細胞,得到核糖核酸誘導多能干細胞,同時使細胞重新編程的速度提高了一倍,而效率是標準方法的100倍以上。(2)轉運載體的選擇,導入的外源因子包含腫瘤相關基因并不是威脅iPSCs安全性的唯一因素,協助轉錄因子轉染所用的病毒載體也有誘發腫瘤的風險,為此,尋找更為安全的載體成為iPSCs研究的另一熱點。A、病毒載體: 無論用逆轉錄病毒慢病毒還是腺病毒做載體均可能增加病毒感染細胞的風險,為此,Mostoslavsky等首次完成了僅用1個病毒載體同時表達4種轉錄因子,減少了細胞中病毒整合的位點,也降低了插入突變的概率。B、質粒載體: 為了擺脫病毒載體插入細胞基因組造成的風險,有人嘗試使用更為安全的質粒載體。在2008年Yamanaka等用兩個質粒反復感染MEF獲得iPSCs其中一個為包含Oct4 Sox2 Klf4的cDNA序列; 另一個為c-Myc的cDNA序列,但由于此法需要質粒的多次反復感染,操作較為復雜,故未得到大范圍應用。
  3.iPS的應用
  2.2 iPS在臨床治療中的可行性
  iPS 細胞的建立進一步拉近了干細胞和臨床疾病治療的距離, iPS 細胞在細胞替代性治療以及發病機理的研究、新藥篩選方面具有巨大的潛在價值。2007年12月, Hanna等用 iPS 細胞成功治療了小鼠的鐮狀紅細胞貧血癥, 2009年初, Xu 等用從 iPS 細胞誘導來的內皮前體細胞和內皮細胞成功治療血友病A,他們的研究雖然是在小鼠中進行的, 然而,這些成果驗證了iPS細胞在基因治療中的可行性, 從理論和實踐上為人類單基因遺傳病治療奠定了基礎。此外, iPS 細胞在神經系統疾病、心血管疾病等方面的作用也日益呈現, iPS 細胞在體外已成功地被分化為神經元細胞、神經膠質細胞、心血管細胞和原始生殖細胞等,在臨床疾病治療中具有巨大的應用價值。
  2.3 iPS為疾病研究提供體外模型
  疾病特異性 iPS 細胞是研究疾病發生機理的重要工具,可以更好地研究疾病發病的機理、篩選和開發新的藥物治療方法。2008年 Dimos 等首次把來自于 80 多歲的肌萎縮側索硬化癥患者的皮膚細胞誘導為 iPS 并分化成運動神經元。Park 等將10種不同遺傳病患者的細胞誘導為病人特異性的 iPS 細胞系。
  2.4 iPS用于治療罕見疾病
  美國斯隆-凱特林研究所的 Lee 等研究人員首次用 iPS 細胞建立了家族性植物神經功能不全癥(Familial dysautonomia, FD)的細胞模型。2012年,美國印第安納大學報道,他們日前用人類誘導多能干細胞( iPSc) 療法,成功治愈了一名回旋狀脈絡膜視網膜萎縮癥患者。
  2.5 iPS細胞應用于體細胞核移植技術
  利用 iPS 細胞作為核供體細胞, 同適當的受體細胞融合后便可以直接獲得轉基因動物。這種將 iPS 細胞誘導技術同動物轉基因技術相結合的方法,不僅可以提高動物的遺傳本質, 而且可以打破物種的界限, 獲得用傳統的交配方法無法得到的動物新性狀。
  2.6 利用iPS技術培育轉基因豬
  利用iPS技術培育出一種準確的轉基因豬, 改善它對某種疾病的耐性, 從而改善畜牧業。目前, 在牛、羊等其它大家畜中尚無這方面的報道, 如果我們能夠建立這些動物的iPS細胞, 并應用其來生產基因打靶或轉基因動物, 必然會提高轉基因動物的效率,為轉基因研究開創一片更加廣闊的天地。
  4.iPS的展望
  隨著研究的深入,以前被人們廣泛認可的iPSC在移植免疫排斥倫理學方面的優勢,以及與ESCs的相似性等問題都受到了質疑。最初人們賦予iPS極高的熱情現如今已漸漸褪去,但iPS的研究不會因此而停下腳步。盡管迄今產生的iPS仍存在著一些問題,iPS在再生醫學領域還是具有巨大的應用前景。為了使iPS安全地應用到臨床,除了提高重編程效率,進行特定組織的高效定向誘導分化之外,未來對iPS的研究同時應關注與臨床應用相關的問題。一旦實現可行、安全、高效、無病毒、無轉基因的自體iPS細胞技術,必將給醫學研究及多種疾病治療帶來深遠的影響。
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